功能回复实验，或称为功能挽救实验、回补实验，是我们基础机制研究中不可缺少的一环，也是体现课题严谨程度，决定发文水平的重要标准。然而，对于很多初入基础科研门槛，尤其是研究生来说，功能回复实验的设计往往容易顾此失彼，甚至越绕越乱。不恰当的功能回复实验不仅会破坏课题的科学性和逻辑性，还可能获得错误的结果，得出错误的结论，或错失重要的发现。因此，今天我们来说说，功能回复实验到底要怎么设计？功能回复实验本质是什么？我们为什么要做功能回复实验？其实，功能回复实验就是用来验证分子与分子、分子与通路、分子与表型之间特异性关系的方法，既能证明信号轴中各元素的上下游（或者是因果）关系，也能证明元素之间调控的具体作用方式。关键在于功能回复前后与相应的对照进行比较。
如果把A基因敲降干预，则增殖能力不再提升，这属于单基因功能验证；
如果把A基因过表达干预，同时抑制B通路激活，增殖能力同样不能再提升，这就是功能回复。
如果功能回复实验总是那么简单就好了。然而大多数情况下，事情可没这么简单。究其原因，生物学中的分子调控是个网状，而非绝对线性的模式，因此单纯这样A→B通路→增殖表型的理想型独立信号轴往往不存在，更多的是会受到很多其它分子、因素的干扰。
实际上的调控是这样的：
比如可能的干扰因素有：
除B以外的C、D、E通路也调控增殖，也可能是A的下游，但由于B的作用重要性高，即使A和B不在一条轴上，干扰A，同时干扰B也能获得功能回复应有的表型。这就会产生一种假象或者谬误。
因此，要排除一些干扰，证明这条调控轴至少确实是上下游调控关系，需要引入B通路中比较关键的节点分子B1。如果A和B1能直接作用，那么A通过B通路调控增殖表型的证据就更充分。
尽管我们完善了A→B1→B通路→增殖表型的信号轴模型，仍会有一些问题被忽略。假设A的功能是甲基化酶，我默认A对B1的作用是DNA甲基化，并且证明了A能结合B1启动子，并对其进行甲基化修饰。这样就万无一失了吗？
非也。
还有其它可能性会导致A对B1的调控，而这在单纯干预A之后，再干预B1的功能回复实验中是无法体现的，比如A也可以通过调控C（假设是个转录因子）的甲基化，C再调控B1，间接影响B1的表达。
如何避免这类问题？
如果已证明A通过DNA甲基化调控B1，最简单的方法就是过表达A，同时将A的甲基化位点修饰活性位点进行无义突变（功能自挽救），然后检测下游B1的表达量和通路、表型；也可以通过过表达A，但突变B1启动子上的甲基化位点，消除A对B1的甲基化修饰效应，再检测下游的通路、表型变化程度，这样不仅能证明A对B1/B通路/表型的调控功能主要是直接的甲基化修饰，而且还能在检测结果不如意（比如通路、表型变化不大或部分回复）的时候快速发现问题，调整方向。
① A不仅直接调控B1，还直接调控B通路中的B2；② A不仅通过B通路调控增殖表型，还可以通过D通路调控；③ A不仅有对DNA的甲基化修饰功能，也能修饰蛋白的甲基化；这些不能排除的可能性均可以通过各种点突变的设计来一一排除。
下次再设计功能回复实验的时候，记得三个要点：
一是假设中的上下游关系；
二是上下调趋势；
三是基于功能的点突变方法。
相信就能理出一条清晰的思路，不会再乱糟糟一头雾水啦。
